在實(shí)驗(yàn)操作過程中，需特別注意以下幾點(diǎn)以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和安全性：

1. 抗體保存與解凍
抗體應(yīng)嚴(yán)格保存于-20℃或更低溫度，避免反復(fù)凍融。使用時(shí)置于冰上緩慢解凍，解凍后輕輕混勻，避免劇烈震蕩導(dǎo)致抗體變性。分裝保存可減少凍融次數(shù)，維持抗體活性。

2. 樣本處理規(guī)范
細(xì)胞或組織樣本需在預(yù)冷的PBS中快速清洗，防止目標(biāo)蛋白降解。裂解液應(yīng)含足量蛋白酶抑制劑，操作全程保持低溫環(huán)境（4℃以下）。離心后取上清需避免吸入沉淀物，確保樣本純度。

3. 抗體稀釋與孵育
根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋比例（建議1:500-1:2000），使用含1% BSA的TBST緩沖液稀釋可降低非特異性結(jié)合。孵育時(shí)密封覆膜防止蒸發(fā)，搖床轉(zhuǎn)速控制在60rpm以內(nèi)，避免機(jī)械力破壞抗原表位。

4. 對照設(shè)置關(guān)鍵性
必須設(shè)立空白對照（僅二抗）、同型對照（同亞型無關(guān)抗體）及陽性對照（已知表達(dá)BMP4的細(xì)胞系）。建議增加內(nèi)參（如β-actin）驗(yàn)證上樣量一致性，異常結(jié)果需重復(fù)三次以上。

5. 顯色與終止時(shí)機(jī)
化學(xué)發(fā)光法檢測時(shí)，ECL工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用。顯影時(shí)間根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度動(dòng)態(tài)調(diào)整（通常10-120秒），強(qiáng)信號(hào)背景下可縮短曝光時(shí)間。酸性終止液加入后10分鐘內(nèi)完成掃描，避免膜干燥。

6. 廢棄物處理
接觸抗體的槍頭、離心管等按生物危害廢物處理，含抗體廢液需用10%次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘后再廢棄。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面用75%乙醇擦拭消毒，避免交叉污染。